PARPtrap PARP2检测试剂盒：均相、免洗、高通量

在肿瘤治疗领域PARP抑制剂已取得显著成功其作用机制不仅在于抑制PARP酶的催化活性更关键的是将PARP蛋白“捕获”在DNA损伤位点形成致命的PARP-DNA复合物导致癌细胞死亡。然而第一代PARP抑制剂主要靶向PARP1对PARP2的选择性及捕获效应研究相对不足。随着研究发现PARP2在前列腺癌等恶性肿瘤中过表达并通过FOXA1/AR通路参与疾病进展开发能够特异性诱导PARP2-DNA捕获的小分子抑制剂成为新的药物发现方向。由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的PARPtrap Assay Kit for PARP2货号78296正是为高通量筛选和表征PARP2捕获型抑制剂而设计的完整解决方案。该试剂盒采用荧光偏振Fluorescence Polarization, FP技术在均相体系中实时检测PARP2与DNA的结合状态可快速评估化合物促进PARP2-DNA复合物形成的能力。以下从检测原理、试剂盒组分、应用场景及操作要点等方面进行详细介绍。图1测定原理。SARM1的水解酶活性是通过监测Etheno-NAD水解形成Etheno-ADPR烟酰胺的过程来测量的。由于内部猝灭作用Etheno-NAD本身不具有荧光性。当被SARM1水解时烟酰胺被释放出来导致荧光信号增强且荧光信号的增强与酶活性直接成正比。一、检测原理荧光偏振法监测PARP2-DNA相互作用荧光偏振技术基于小分子在溶液中的旋转速度与其分子量之间的关系。当荧光标记的小分子如寡核苷酸探针处于自由状态时旋转速度快发射光偏振程度低当该分子与较大的蛋白质如PARP2结合后复合物旋转速度减慢发射光偏振程度显著升高。本试剂盒的核心设计如下1. 荧光标记的DNA双链探针提供一条末端带有荧光基团如FAM的双链寡核苷酸模拟DNA损伤位点的结构。2. 重组人源PARP2酶氨基酸2-583包含完整的DNA结合域及催化域具有NAD⁺依赖性自身核糖基化活性。3. NAD⁺作为PARP2的底物在未添加抑制剂时PARP2结合DNA后会发生自身PARylation负电荷积累导致其从DNA上解离。4. 待测化合物若化合物具有“捕获”功能则会阻止PARP2从DNA上解离使其稳定结合在DNA探针上。检测流程将PARP2酶、荧光DNA探针、NAD⁺及待测化合物混合孵育。在无捕获剂时PARP2结合DNA后迅速发生自身修饰并解离荧光偏振值较低在存在捕获型抑制剂时PARP2被锁定在DNA上形成高分子量复合物荧光偏振值显著升高。通过测定偏振值mP的变化即可量化化合物的捕获活性。二、试剂盒组分与规格该试剂盒提供两种规格96孔板形式100次反应和384孔板形式400次反应每个试剂盒包含重组人PARP2酶2-583氨基酸纯度及活性经质控验证荧光标记的寡核苷酸双链避光保存NAD⁺需按说明溶解使用PARPtrap 检测缓冲液优化了离子强度及pH确保最佳结合效率详细操作说明书所有组分在收货后按指示存储通常为-80°C自收货之日起6个月内保持最佳性能。荧光探针对光敏感建议分装后避光保存避免反复冻融。三、核心应用场景本试剂盒主要面向两大药物发现需求1. 高通量筛选HTS促进PARP2-DNA捕获的小分子传统的PARP酶活性抑制试验仅能反映化合物对催化活性的抑制无法区分“催化抑制”与“DNA捕获”两种机制。而PARPtrap试剂盒直接检测PARP2-DNA复合物的稳定性可精准识别能够增强而非破坏该复合物的化合物。这对于开发具有更强细胞毒性效应的下一代PARP抑制剂如PARP2选择性捕获剂至关重要。试剂盒兼容自动化移液工作站384孔板格式支持每天数千个化合物的筛选。2. 先导化合物的IC₅₀测定及机制表征对于筛选出的阳性化合物可进一步进行剂量-响应曲线分析计算其促进PARP2-DNA捕获的半效浓度EC₅₀或IC₅₀。由于荧光偏振读数稳定、Z因子高该方法能够可靠区分不同化合物之间的效力差异。研究者还可以通过改变NAD⁺浓度或DNA序列探究化合物的作用模式如是否与DNA结合位点竞争。四、实验流程简要说明1. 试剂准备将PARP2酶、荧光DNA探针、NAD⁺及检测缓冲液置于冰上解冻避光保存荧光探针。准备待测化合物建议使用DMSO溶解并设置浓度梯度。2. 反应体系构建384孔板推荐方案每孔加入10 uL检测缓冲液随后加入2 uL PARP2酶终浓度优化范围为10–100 nM2 uL荧光DNA探针终浓度5–20 nM2 uL NAD⁺终浓度100 uM以及2 uL待测化合物或DMSO对照。总体积调整至20 uL。3. 孵育与读数室温避光孵育30–60分钟。使用荧光偏振酶标仪激发波长485 nm发射波长535 nm分别测量平行偏振S和垂直偏振P信号计算偏振值mP 1000 × (S - G×P)/(S G×P)其中G为仪器校正因子。4. 数据分析将化合物孔的mP值与阴性对照无化合物PARP2正常解离及阳性对照使用已知捕获型抑制剂如奥拉帕尼或特定PARP2工具化合物进行比较。捕获活性% (mP_compound - mP_min) / (mP_max - mP_min) × 100%绘制剂量-响应曲线拟合EC50。五、注意事项与配套建议物种特异性试剂盒提供人源PARP2重组蛋白其DNA结合域与啮齿类动物同源性较高但跨物种验证需用户自行评估。阳性对照首次使用建议运行已知的PARP捕获剂如talazoparib虽主要靶向PARP1但对PARP2也有一定捕获效应以确认体系性能。背景控制无PARP2酶的孔作为空白对照测定荧光探针的基础偏振值。NAD⁺缺失的孔可反映最大结合信号因无自身修饰解离。辅助设备需要具备荧光偏振检测模块的多模式酶标仪以及黑色、低自发荧光的384孔板。干扰排除某些化合物自身可能具有荧光或淬灭效应建议设置“化合物荧光探针无酶”对照孔排除假阳性。六、文献参考Murai J., et al., 2014 Molecular Cancer Therapeutics 13: 433-443Murai J., et. al., 2012 Cancer Research 72: 5588-5599Zandarashvili L., et al., 2020 Science 368(6486): 6367Marques M., et al., 2019 Oncogene 38 (12): 2177-2191.